UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI JELLYFISH Rhopilema esculentum

Antioksidan adalah senyawa yang dapat menetralkan radikal bebas, seperti enzim SOD (Superoksida Dismutase), gluthatione dan katalase.Selain itu antioksidan juga dapat diperoleh dari makanan yang mengandung vitamin C, betakaroten serta asam fenolik. Bahan pangan yang menjadi sumber antioksidan alami adalah buah-buahan, sayuran, rempah-rempah, cokelat dan biji-bijian (Prakash 2001 dalam  Maulida dan Zulkarnaen 2010).

Antioksidan adalah zat yang mampu memperlambat atau menghambat proses oksidasi. Senyawa ini mampu melindungi sel dari efek yang berbahaya yaitu dari radikal bebas oksigen reaktif yang berkaitan dengan penyakit.Radikal bebas merupakan spesies yang tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dan mencari pasangan elektron dalam makromolekul biologi.Protein lipida dan DNA sel manusia merupakan pasangan electron yang baik.Radikal bebas berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor eksternal lainnya.Kondisi oksidasi dapat menyebabkan kerusakan protein dan DNA, kanker dan penuaan.Penuaan merupakan suatu gangguan metabolisme. Gangguan glycometabolismeakan mengarah pada kelainan metabolisme jantung, hati, ginjal, otak dan organ vital lainnya, akhirnya penuaan muncul. Untuk mengurangi radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh, maka kita perlu mengkonsumsi buah dan sayur yang mengandung vitamin C, vitamin E dan karotenoid. Dalam paper ini akan dibahas bahan antioksidan yang berasal dari jellyfish Rhopilema esculentum.

Jellyfish merupakan organisme kelas Scypozoa, orde Rhizostomeae dan family Rhopimela.Spesies yang digunakan adalah Rhopilema esculentum, spesies ini merupakan spesies yang memiliki nilai ekonomis tinggi, yang berperan sebagai pemutar roda perekonomian di pasar perikanan Asia.China adalah negara pertama yang memproses jellyfish untuk dikonsumsi manusia, dan orang-orang Cina telah menggunakan jellyfish sebagai seafood selama lebih dari seribu tahun silam.Jellyfishmemiliki kandungan gizi yang tinggi, kaya akan protein, kalsium, fosfor, yodium, zat besi, vitamin dan lain sebagainya. Jellyfish terdiri dari air dan protein.Pada jellyfish kering 50% berat terdiri dari protein, dengan gula beberapa persen dan tidak ada lemak dan kolesterol, sehingga jellyfish merupakan makanan sehat yang kaya protein dan rendah lemak. Disamping itu, diyakini jellyfish juga memiliki  banyak khasiat uuntuk kesehatan, diantaranya bisa menyembuhkan penyakit arthritis, hipertensi, nyeri punggung, bisul, tracheitis, asma, sembelit, menambah kecantikan dan mengurangi kelelahan. Jellyfish juga berpotensi untuk membangun kembali otot, tulang rawan dan tulang, protein aktif yang ada didalam Rhopilema esculentum memiliki aktivitas antioksidan.

In Vitro determination of antioxidant activity of proteins from jellyfish Rhopilema esculatum

1               Bahan dan Metode

1.1         Bahan Kimia

Bahan Kimia yang digunakan meliputi Bovine serum albumin (BSA), butylated hydroxyanisole (BHA), nicotinamide adenine dinucleotide-reduced (NADH), nitro blue tetrazolium (NBT), phenazine methosulphate (PMS), hydrogen peroxide (H2O2), ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA), potassium ferricyanide and ferric chloride were purchased from Sigma. Sephadex (G-100, G-50, G-200).

1.2         Isolasi Protein

Ubur-ubur jenis R.esculentum diambil di teluk Aoshan di Qingdao, Provinsi Shandong, China pada Bulan Agustus 2003.Bagian mulut lengannya dipotong secara in vivo kemudian di masukkan kedalam kantong plastik dan dibekukan dengan suhu 20˚C. Lengan yang sudah beku di isonifikasi dalam suhu 4˚C, kemudian diberikan larutan buffer (0,01 M, pH 6) sebanyak 8 kali setiap 30 detik pada 100 mv.

1.3         Uji Radikal Anion Superoksida

Uji Radikal Anion Superoksida merupakan kemampuan protein yang telah di uji dengan menggunakan metode yang sudah dijelaskan dengan sedikit modifikasi.Radikal Anion Superoksida dihasilkan dalam sistem PMS-NADH melalui oksidasi NADH dan diuji dengan berkurangnya NBT. Dalam penelitian ini, radikal anion superoksida yang dihasilkan dalam 2,5 ml larutan penyangga Tris HCl (16 mM, pH 8,0) yang mengandung 0,5 ml larutan NBT (300 ml) 0,5 ml larutan NADH (468 lm) dan protein sampel (0.47- 290 lg / ml). Penurunan reaksi adsorbansi campuran ditunjukkan pada peningkatan dari nilai uji radikal anion superoksida. Kemampuan Uji Radikal Anion Superoksida dapat dihitung dengan menggunakan persamaan berikut :

% Scavenging effect =  [(A0 - A1)/A0 x 100

Dimana A0 adalah absorbansi kontrol (tanpa sampel protein) dan A1 adalah absorbansi campuran yang mengandung sampel protein.

1.4         Pengujian Radikal Hidroksil

Sebuah reaksi campuran, dengan total volume 4,5 ml, yang mengandung sampel protein sebanyak 0.62–65.10 µg/ml. Kemudian di inkubasi dengan EDTA–Fe²⁺ (220 µM), Safranine O (0.23 µM) dan H2O2 (60 µM) dalam buffer fosfat potasium (150 mM, PH 7.4) selama 30 menit dengan suhu 37˚C. Absorbansi campuran diukur pada 520 nm. Setelah itu, Radikal hidroksil akan memutih dalam safranine O, jadi penurunan reaksi  absorbansi campuran yang ditunjukkan dengan menurunnya kemampuan pengujian radikal hidroksil.

1.5         Total antioksidan menggunakan uji sistem model  Beta -carotene–linoleate

Total aktiffitas Antioksidan dari sampel protein sudah pernah dievaluasi oleh sistem model Beta -carotene–linoleate (Hidalgo, Ferna´ndez, Quilhot, & Lissi, 1994) dengan sedikit modifikasi. Asam linoleic (20 mg) dan Tween-40 (200 mg) dicampurkan dengan 0.5 ml chloroform.chloroform dipindahkan pada 40 °C di bawah vacum menggunakan rotary evaporator. Hasil campuran dengan seketika dicairkan dengan 10 ml air saringan sebanyak 3 kali dan di aduk selaman 1-2 menit.Selanjutnya emulsi dibuat memadai hingga 50 ml dengan air oksigen. Aliquots (4ml) dari emulsi di transfer ke tabung berbeda berisi 0,2 ml sampel protein. BHA digunakan untuk tujuan perbandingan. Sebuah kontrol, diisi 0,2 ml air saringan dan 4 ml emulsi yang telah disiapkan. Tabung reaksi ditempakan pada suhu 50°C di kamar mandi. Absorban dari semua sampel pada 70 nm di ambil pada waktu 0 (t=0), ukuran absorban dilanjutkan hingga warna beta –carotene menghilang pada reaksi kontrol (t = 270 menit) pada interval 30 menit (gambar 1). Sebuah campuran telah disipakan sebelumnya, tanpa Beta –carotene, disajikan kosong.Semua penentuan diselesikan sebanyak 3 kali.

Fig. 1.Chromatogram of R. esculentum protein by Sephadex chromatography. (a) Chromatogram of crude protein by Sephadex G-100 chromatography, two major protein peaks were obtained at the flow rate of 25 ml/h. (b) Chromatogram of the second peak by Sephadex G-50 chromatography, one protein peak was obtained at the flow rate of 25 ml/h. (c) Chromatogram of the first peak by Sephadex G-200 chromatography, one protein peak was obtained at the flow rate of 25 ml/h.

1.1         Penentuan Pengurangan Power

Pengurangan power sampel protein ditentukan menggunakan metode Yen and Duh (1993). Perbedaan konsentrasi sampel protein dalam 3,5 ml penyangga fosfat (0.2 M, pH 6.6) yang dicampurkan dengan 2.5 ml dari 1% potassium ferricyanide dalam tabung 10 ml. Campuran diinkubasi selama 20 menit pada suhu 50°C. Di akhir inkubasi, tambahkan 2.5 ml dari10% asam trichloroacetic diikuti dengan sentrifugasi pada 5000 rpm selama 10 menit. Cairan supernatant (2,5 ml) ditambahkan dengan 2,5 ml air saringan dan 0,5 ml dari 0,1 % ferric chloride dan absurban di takar pada 700 nm. Tes pengurangan power dilakukan sebanyak 3 kali. Kenaikan absorban dari campuran reaksi merupakan indikasi pengurangan power sampel protein

1.2         Aktifitas Chelat Metal

Chelating ion sulfida besi belerang sebagai sampel dan standart telah di estimasi oleh metode dari Dinis, Madeira,and Almeida (1994). Sampel di tambahkan ke sebuah larutan 2 mM FeCl2 (0,05 ml). Reaksi akan bereaksi ketika ditambahkan 5 mM ferrozine (0,2 ml) dan di aduk secara merata lalu biarkan pada suhu ruang selama 10 menit. Setelah percampuran merata, larutan absorben kemudian ditakar dengan spectrophotometrical pada 562 nm.Semua analisa dilakukan sebanyak 3 kali. Persentase hambatan ferrozine –Fe²⁺ formasi komplek diberikan formula seperti dibawah ini :

% persentasae Chelating = [(A₀  - A1)/ A₀] x 100;

Dimana A₀ adalah kontrol absoerban dan A₁ adalah persentase absorbean pada sampel dan standart.Kontrol diisi FeCl2 and ferrozine, formasi molekul kompleks.

1.3         Analisa Statistik

 Semua data menyatakan bahwa titik tengah kurang lebih  SD dari ukuran tiga paralel. Data yang dianalisis oleh mahasiswa menggunakan t-test dan semua test dipertimbangkan secara signifikan pada p<0 o:p="">

2.             Hasil

2.1         Isolasi Protein

Dua puncak protein utama muncul dalam elusi Sephadex G-100 (Gambar. 1 (a)). Volume yang dielusi dari puncak pertama adalah 14,8 ml dan hampir sama dengan volume kosong (14 ml), Volume yang dielusi dari puncak kedua 36 ml. Dalam rangka untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, Sephadex G-50 dan Sephadex G-200 yang diterapkan untuk mengisolasi puncak kedua dan puncak pertama, masing-masing, dan satu puncak diperoleh oleh Sephadex G-50 kromatografi dan Sephadex G-200 kromatografi (Gambar. 1 (b) dan (c)).

Volume yang dielusi dari puncak protein hampir sama dengan volume yang  kosong dari kromatografi Sephadex G-200, hal ini menunjukkan bahwa berat molekul puncak yang pertama terlalu tinggi untuk melampaui kisaran isolasi dari Kromatografi Sephadex G-200 dan filtrasi gel chromatographfy tidak bisa mengisolasi protein pertama

2.2         Pengujian Radikal Anion Superoksida

Dalam PMS / NADH-NBT sistem, anion superoksida radikal berasal dari oksigen terlarut oleh PMSNADH yang bereaksi kopling mengurangi NBT.Penurunan absorbansi, pada 560 nm, dengan antioksidan menunjukkan konsumsi radikal anion superoksida di campuran reaksi.

Tabel 1 menunjukkan persentasi efek pembilasan pada radikal anion superoksida protein kasar (CP), puncak pertama (FP) dan puncak kedua (SP).Sampel protein memiliki anion superoksida yang kuat. Untuk CP, pada konsentrasi dari 19,34 290 lg / ml, presentase efek pembilasan di superoksida yang memiliki anion radikal dari 21,0% menjadi 89,5%. Dampak pembilasan tergantung pada konsentrasi dan korelasi di antara mereka; koefisien korelasi (r) adalah 0,9861 (Tabel 3). Untuk FP, pada konsentrasi 3,13-31,3 lg / ml.

FP dan SP menunjukan superoksida kegiatan radikal-pembilasan jauh lebih tinggi daripada melakukan BHA, BHT, atau-tokoferol. Efek superoksida anion radikal-pembilasan dari sampel protein adalah seperti berikut: SP> FP> CP.

2.1         Pengujian Pembilasan Hidroksil Radikal

Hidroksil radikal, diketahui akan dihasilkan melalui reaksi Fenton dalam sistem ini, telah dilakukan pembilasan oleh sampel protein. Tabel 2 menunjukkan efek pembilasan sampel dan standar protein.

Untuk CP, pada konsentrasi 13,0-65,1 lg / ml, efek pembilasan adalah dari 10,6% menjadi 69,3%. Untuk FP, pada konsentrasi 1,12-44,9 lg / ml, efek yang dicari tersebut dari 3,46% menjadi 68,6%. Untuk SP, pada konsentrasi dari 0,62-9,99 lg / ml, efek yang dicari tersebut dari 17,2% menjadi 94,5%. Korelasi antara efek pembilasan dan konsentrasi CP dan FP adalah linier dan rs adalah 0,9968 dan 0,9957, masing-masing; Adapun SP, korelasi adalah logaritmik dan r adalah 0,9722 (Tabel 3). 

Tiga protein sampel menunjukkan jauh lebih tinggi radikal hidroksil-pembilasan Kegiatan vitamin C atau manitol. Nilai EC50 CP, FP dan SP adalah 48,8, 45,4 dan 1,52 lg / ml, tetapi EC50 nilai Vitamin C dan manitol adalah 1.907 dan 4.536 lg / ml, masing-masing. Hidroksil yang Efek radikal-pembilasan sampel protein dan standar diikuti urutan: SP> FP> CP> Vitamin C> manitol.

2.1              pengukuran total antioksidan menggunakan system β-caroten-linoleat

Total sampel yang digunakan adalah 50µg dilakukan dengan cara bleaching. Hasilnya adalah CP (Crude Protein) dan SP (Second Peak) memperlihatkan bermacam-macam derajat dari aktifitas antioksidan. Jumlah antioksidan dari SP lebih kuat dari pada total antioksdan pada CP sedangkan FP tidak memperlihatkan aktifitas antioksidan. Hasil diatas dilakukan dengan satu cara yang sama. Dalam system/cara ini, ketidakadaan warna dapat diartikan bahwa tidak ada aktifitas antioksidan.Perubahan warna pada karakteristik kromofor dapat dilihat menggunakan spektrofotometri. Keberadaan protein juga akan menghalang-halangi perluasan β-caroten-bleaching.

2.1              Reduktif Power

Untuk pengukuran kemampuan mereduksi, Fe³⁺ dan Fe²⁺  perubahan dngan adanya protein dari sampel. Kemampuan protein mereduksi dapat dlihat di tabel dibawah ini.

Dari tabel diatas, 3 sampel sangat lemah.Dan semua mengabsorban masing-masing A700 dibawah 0.07.

2.1              Aktifitas metal chelating

Kemampuan chelating dari sampel dan EDTA disajikan pada tabel dibawah ini.Dari 3 tabel, kemampuan chelating dari FP merupakan yang terkuat namun jauh lebih lemah dari EDTA.

Aktifitas antioksidan diduga aktifitas antioksidan yang merupakan hasil dari variasi mekanisme, diantara inisiasi rantai, binding dari transisi ion metal katalis, dekomposisi dari peroxides, prevensi dari keberlanjutan abkstraksi hydrogen, kapasitas reduktif dan radikal-scavenging. Untuk tiga protein, kami dapat mengeliminasi mekanisme reductive capacity karena mereka lemah dalam kemampuan mereduksi.Beberapa antioksidan pada organism termasuk protein dan protein memainkan peran penting dalam sisten pertahanan (antioksidan).Kekurangan protein tidak hanya dapat merusak sintesa enzim antioksidan melainkan juga mengurangi konsentrasi jaringan dari antioksidan.

2.                  Kesimpulan

SP menunjukkan kekuatan dari superoxides anion radical-scavenging, hydroxyl radical-scavenging dan total aktifitas antioksidan. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa SP memiliki kemungkinan untuk digunakan dibidang pangan dan industri obat. Aktifitas antioksidan dari sampel protein mungkin menjelaskan bahwa ubur-ubur dapat menyembuhkan penyakit seperti bronchitis,tracheitis, gastric ulcers dan asma.

Study on effect of jellyfish collagen hidrolysate on anti-fatigue and anti-oxidation

Pada jurnal ini jellyfish diperoleh dari PelabuhanXiangshan, provinsi Zhejaing, Cinadan segeradisimpanpada suhu 20^oCsebelum digunakan. Penelitian ini menggunakan target tikus dengan berat 18 gram dan 22 gram. Tablet QingchunbaoYongZhen, yang fungsinyaadalah menyesuaikankekebalan tubuh dan menunda penuaan. Kotak (kits) yang mencakup malonaldehyde(MDA), superoksidadismutase(SOD), Glutathioneperoksidase(GSH-Px), blood lactic acid, blood urea nitrogen (BUN), hepatic glycogen dan  muscle glycogen , D-galaktosa (Amersco Perusahaan), Protamexdanreagenlainnyayang digunakandalam penelitian ini adalahkelasanalitis.

1                    Metode                                                                                                               

1.1              Persiapan jellyfish collagen hydrolysate (JCH)

Ubur-ubur dibilas dengan air suling, kemudian diekstraksi dengan menggunakan pelarut 0,1 mol/L NaOH dan diaduk 2d untuk melepas protein non-collagenous dengan suhu 4°C, kemudian direndam kembali dengan 2% protamex pada suhu 50°C selama 8 jam. Larutan dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit untuk menonaktifkan enzim dan disentrifugasi pada 4000 r/menit selama 10 menit. JCH disimpan dalam suhu -20°C sebelum digunakan.

1.2              Percobaan Anti-oksidan

Percobaan antioksidan menggunakan 50 tikus dengan dikelompokkan berdasarkan berat badan setelah satu minggu diadaptasi.Terdapat 5 kontrol yang digunakan, diantaranya kelompok kontrol, kelompok anti penuaan (aging model), kelompok dengan dosis rendah, kelompok dengan dosis tinggi dan kelompok positif. Kelompok kontrol diberi air suling (10 ml/kg/d) secara gavage, kelompok yang lain ditambahkan D-galaktose (1000 mg/kg/d) melalui injeksi subcutaneous, sedangkan model anti penuaan ditambahkan dengan air suling (10 ml/kg/d) secara gavage. Kelompok untuk percobaan ditambahkan enzim hydrolysate 5 ml/kg/d (konsentrasi rendah), 10 ml/kg/d (konsentrasi tinggi) dan kontrol positif ditambahkan tablet Qingchunbao Yong Zhen (4 g/kg/d), ditunggu selama enam minggu dan semua bioassay dideteksi dengan menggunakan kotak (kits).

Penentuan kadar MDA, SOD dan aktivitas GSH-Px: Setelah berpuasa selama 12 jam, tikus diberi bahan uji, 30 menit kemudian, darah dikumpulkan melalui bola mata, dan serum yang terisolasi untuk digunakan. Sementara hati dikumpulkan untuk dibuat menjadi 10% homogenat pada 4^oC dengan normal saline. Penentuan dan metode operasi dilakukan sesuai dengan yang direkomendasikan prosedur yang disediakan oleh kit.

2                    Hasil dan pembahasan

Penuaan merupakan hasil gangguan metabolisme. Gangguan glycometabolisme yang akan mengarah pada kelainan metabolisme jantung, hati, ginjal, otak dan organ vital lainnya, pada akhirnya muncul penuaan. Radikal oksigen endogen yang dihasilkan dalam sel akan mengakibatkan pola peningkatan kerusakan organ.

Penuaan tikus disebabkan oleh D-galactose.D-galactose telah banyak digunakan untuk anti-penuaan dan pengujian kesehatan makanan di China. Hewan yang diberi D-galactose dalam jangka waktu tertentu dan dalam dosis tinggi secara terus menerus tereduksi galactitol oleh reduktase aldosa, namun galactitol tidak dapat dimetabolisme oleh sel dan menumpuk dalam sel, sehingga  mempengaruhi tekanan osmotik, dan mengakibatkan pembengkakan sel , disfungsi, gangguan metabolisme, yang pada akhirnya menyebabkan terjadinya penuaan. Peningkatan radikal bebas akan mempercepat penuaan.

MDA adalah salah satu produk akhir dalam proses peroksidasi lipid, yang meningkatkan penuaan. Sistem antioksidan enzim (termasuk SOD, GSH-Px dll.) penting dalam menangkal radikal bebas, produk metabolisme, serta dalam menjaga fisiologi seluler yang normal, kekebalan, dan mencegahan berbagai penyakit. MDA berisi serum dan homogenat hati dalam Aging Model memiliki tingkat yang lebih tinggi secara signifikan dibanding kelompok lain (P <0 atau="" o:p="" p="">

Tikus pada Aging Model menunjukkan tingkat penurunan aktivitas GSH-Px dibandingkan dengan kelompok lain (P <0 aging="" aktivitas="" analisis="" dalam="" dan="" dengan="" di="" dibandingkan="" gsh-px="" hati="" homogenat="" kecenderungan="" kelompok="" lain="" memiliki="" mengalami="" meningkat="" menunjukkan="" mereka="" model.="" model="" penurunan="" perbedaan="" serum="" signifikan="" sod="" span="" statistik="" tetapi="" tidak="" tikus="" untuk="" yang="">

Aktivitas antioksidan protein adalah  interaksi kompleks antara kemampuan mereka untuk menonaktifkan spesies oksigen reaktif, radikal bebas, logam transisi peroksidatif. Mekanisme radikal dimensi oksidasi bebas dari asam amino, peptide dan protein terhadap radiasi pengionan dalam kondisi OH atau OH dan O² terbentuk.Peptida merupakan antioksidan yang potensial dari asam amino yang dapat mengakal darikal bebas.

Dari penelitian tersebut dapat diperoleh kesimpulan bahwa MDA pada serum darah dan hati homogenate dalam model Aging (penuaan) memiliki tingkat yang signifikan lebih tinggi. Pada tikus model aging menunjukkan penurunan aktivitas pada serum GSH-Px dan aktivitas SOD pada homogenate hati dibandingkan dengan kelompok lain. Jadi, JCH memiliki efek anti-oksidatif pada penuuan pada tikus.

Referensi

Yu, H., Liu, X., Xing, R., Liu, S., Gao, Z., Wang, P., et al. 2006. In vitro determination of antioxidant activity of proteins from jellyfish Rhopilema esculentum.Food Chemistry. 95: 123-130.

Ding, J., Li, Y., Xu, J., Su, X. Gao, X., Yue, F.2011. Study on effect of jellyfish collagen hydrolysate on anti-fatigue and anti-oxidation. Food Hydrocolloids. 25: 1350-1353.

Maulida, D. dan Zulkarnaen, N. 2010.Ekstraksi antioksidan ( likopen ) dari buah tomat dengan menggunakan solven campuran, n – Heksana, aseton, dan etanol. Skripsi Universitas DIponegoro  Semarang.